【導(dǎo)讀】流式細(xì)胞術(shù)被臨床醫(yī)生和診斷醫(yī)生廣泛用于分析細(xì)胞特性。他們用光學(xué)方法逐一評(píng)估每個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量、血液健康狀況、粒度和細(xì)胞大小等屬性。盡管系統(tǒng)靈敏度高,但流式細(xì)胞儀的設(shè)計(jì)人員一直面臨著需要加速分析的壓力,這就要求采用新的方法設(shè)計(jì)流式細(xì)胞術(shù)及其相關(guān)電子元件。
本文將簡(jiǎn)要介紹流式細(xì)胞術(shù)系統(tǒng)的工作原理。然后介紹 Analog Devices 的 18 位 ADC 模塊 ADAQ23878,并展示如何利用該模塊來(lái)設(shè)計(jì)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)和轉(zhuǎn)換階段。此外,本文還將介紹一個(gè)可用于評(píng)估流式細(xì)胞術(shù)前端設(shè)計(jì)的評(píng)估套件。希望通過本文,讀者能夠更好地了解流式細(xì)胞術(shù)的高效數(shù)據(jù)采集解決方案。
流式細(xì)胞術(shù)被臨床醫(yī)生和診斷醫(yī)生廣泛用于分析細(xì)胞特性。他們用光學(xué)方法逐一評(píng)估每個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量、血液健康狀況、粒度和細(xì)胞大小等屬性。盡管系統(tǒng)靈敏度高,但流式細(xì)胞儀的設(shè)計(jì)人員一直面臨著需要加速分析的壓力,這就要求采用新的方法設(shè)計(jì)流式細(xì)胞術(shù)及其相關(guān)電子元件。
流式細(xì)胞儀對(duì)各個(gè)細(xì)胞進(jìn)行激光照射,產(chǎn)生散射和熒光信號(hào)。為了快速、準(zhǔn)確地捕捉所產(chǎn)生的光線并將其轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào),需要一個(gè)雪崩光電二極管 (APD) 和復(fù)雜的電子元件。要設(shè)計(jì)和實(shí)現(xiàn)這個(gè)過程的電路可能需要很長(zhǎng)時(shí)間,特別是考慮到流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)需要高速、低噪音的設(shè)備來(lái)確保系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。
為了實(shí)現(xiàn)更快的流式細(xì)胞術(shù)分析并保證成本效益,設(shè)計(jì)人員可以通過由內(nèi)部放大器驅(qū)動(dòng)器和模數(shù)轉(zhuǎn)換器 (ADC) 組成的數(shù)據(jù)采集解決方案解決速度和準(zhǔn)確性問題。
現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)原理
現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)是一個(gè)自動(dòng)化過程,可以分析細(xì)胞和表面分子,描述并定義異質(zhì)細(xì)胞群中的不同細(xì)胞類型。不算準(zhǔn)備時(shí)間(可能超過一個(gè)小時(shí)),該儀器能在不到一分鐘的時(shí)間里對(duì) 10000 個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行三到六個(gè)特征評(píng)估。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn),流式細(xì)胞術(shù)的單細(xì)胞制備步驟至關(guān)重要。樣品在鞘液中組織,以流體力學(xué)方式將細(xì)胞或顆粒聚焦到狹長(zhǎng)的單細(xì)胞列樣品流中,以進(jìn)行分析。在經(jīng)過這種轉(zhuǎn)換后,單細(xì)胞必須保持其自然的生物特征和生化成分。圖 1 是流式細(xì)胞術(shù)儀的示意圖,首先從頂部加入多細(xì)胞樣品。
圖 1:流式細(xì)胞儀示意圖,從鞘液聚焦到數(shù)據(jù)采集。(圖片來(lái)源:Wikipedia,由 Bonnie Baker 修改)
流式細(xì)胞儀包含六個(gè)主要組件:流通池、激光器、雪崩光電二極管 (APD)、跨阻放大器 (TIA)、ADC,以及用于數(shù)據(jù)收集和分析的計(jì)算機(jī)。流式細(xì)胞儀有液流或鞘液,這兩者會(huì)收窄,以將細(xì)胞排列成單列送過光束。激光每次捕獲一個(gè)細(xì)胞,產(chǎn)生前向角散射光 (FSC) 信號(hào)和側(cè)向角散射光 (SSC) 信號(hào)。熒光通過鏡子和過濾器進(jìn)行分類,然后由 APD 進(jìn)行放大。接下來(lái),在產(chǎn)生的光輸出擊中 APD 后對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)、數(shù)字化和分析。對(duì)于檢測(cè)來(lái)說,Analog Devices 的 LTC6268 500 兆赫 (MHz) 超低偏置電流、低電壓噪聲 FET 輸入運(yùn)算放大器對(duì)于檢測(cè)所需的高速 TIA 是理想選擇。
圖 2:TIA 電路使用一個(gè) APD (PD1) 和一個(gè)低輸入電流的 FET 運(yùn)算放大器,將超低的光電二極管電流轉(zhuǎn)換成 IN1+ 的輸出電壓。(圖片來(lái)源:Bonnie Baker)
設(shè)計(jì)此放大器電路時(shí),必須盡可能地?cái)U(kuò)大帶寬,因而必須盡量減少寄生電容。例如,寄生反饋電容 C 影響了圖 2 的電路穩(wěn)定性和帶寬。無(wú)論選擇何種電阻器封裝,在放大器的反饋路徑中總會(huì)存在寄生電容。但是,0805 封裝端蓋間距較長(zhǎng),寄生電容最低,是高速應(yīng)用的首選。增加 R1 端蓋之間的距離并不是減少電容的唯一方法。另一種減少板對(duì)板電容的方法是在電阻 R1 下增設(shè)一條接地線,來(lái)屏蔽產(chǎn)生寄生電容的電場(chǎng)路徑(圖 3)。
圖 3:在反饋電阻下增設(shè)接地線,可從反饋端分流電場(chǎng),并將傾泄至地面。(圖片來(lái)源:Analog Devices)
在這種情況下,該方法具體涉及到在靠近 TIA 輸出端的電阻墊下面和之間放置一條短的接地線。此方法可讓寄生電容達(dá)到 0.028皮法拉 (pF),TIA 帶寬達(dá)到 1/(2π*RF*CPARASITIC),相當(dāng)于 11.4 MHz。光信號(hào)會(huì)導(dǎo)向幾個(gè)帶有適當(dāng)濾光片的雪崩二極管。APD、TIA 和 ADC 系統(tǒng)將這些信號(hào)轉(zhuǎn)換為其數(shù)字表示,并將數(shù)據(jù)發(fā)送到微處理器做進(jìn)一步分析。現(xiàn)代細(xì)胞儀通常配備多個(gè)激光器和 APD。目前的商用設(shè)備有 10 個(gè)激光器和 30 個(gè)雪崩光電二極管。增加激光和光電倍增管檢測(cè)器的數(shù)量,可以進(jìn)行多次抗體標(biāo)記,從而通過表型標(biāo)記精確識(shí)別目標(biāo)細(xì)胞群。
流式細(xì)胞術(shù)聲波聚焦
雖然增加多個(gè)激光器和 APD 可以加速分析和識(shí)別,但在最好的情況下,最新的現(xiàn)代單細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)每分鐘可以收集多達(dá)一百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)。在許多應(yīng)用中,如檢測(cè)血液中低至每毫升 100 個(gè)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞時(shí),這種處理遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。在罕見細(xì)胞的臨床應(yīng)用中,試驗(yàn)經(jīng)常需要對(duì)數(shù)十億的細(xì)胞進(jìn)行分析,非常耗時(shí)。聲波聚焦過程是流體力學(xué)聚焦細(xì)胞制備過程的替代方案。在該過程中,將一種壓電材料(如鋯鈦酸鉛 (PZT))附著在玻璃毛細(xì)管上,使電脈沖轉(zhuǎn)換成機(jī)械振動(dòng)(圖 4a)。通過使用 PZT 在矩形流通池的共振頻率下振動(dòng)玻璃毛細(xì)管的側(cè)壁,系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生具有不同數(shù)量壓力節(jié)點(diǎn)的各種聲駐波。
圖 4:矩形玻璃毛細(xì)管制成的聲學(xué)流通池示意圖 (a)。定寬毛細(xì)管的前三個(gè)壓力節(jié)點(diǎn)的位置 (b)。(圖片來(lái)源:美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心)
這些 PZT 頻率節(jié)點(diǎn)將流動(dòng)的粒子排列成多條離散的流線(圖 4b)。聲學(xué)流通池使用線性聲駐波,通過產(chǎn)生單次或多次諧波來(lái)調(diào)諧為各種波長(zhǎng)。正如簡(jiǎn)單線性駐波模型所預(yù)測(cè)的那樣,樣品中的細(xì)胞在流通池中產(chǎn)生單個(gè)或多個(gè)單細(xì)胞列。借助這種精確的細(xì)胞組織,鞘液隧道的寬度可以擴(kuò)大,以加速流過激光束(圖 5)。
圖 5:對(duì)于流體力學(xué)樣品流(c.和 d.),隨著鞘液寬度增加,細(xì)胞樣品發(fā)生散射,使光學(xué)測(cè)量過程變得困難。無(wú)論鞘液寬度如何,聲波聚焦的樣品流(a.和 b.)都保持單列細(xì)胞。(圖片來(lái)源:Thermo Fischer Scientific)
傳統(tǒng)的流體力學(xué)聚焦(圖 5c.)將單細(xì)胞排成列,準(zhǔn)備進(jìn)行激光掃描。雖然樣品流核心的漏斗越寬,鞘液材料的速度就越快(圖 5d.),但這也會(huì)導(dǎo)致單細(xì)胞列發(fā)生分散,從而產(chǎn)生信號(hào)變化并影響數(shù)據(jù)質(zhì)量。聲波聚焦(圖5a.)將生物細(xì)胞和其他顆粒緊密地排列在一起,即使隧道較寬也沒有問題。這種精確的細(xì)胞排列允許更高的采樣率,同時(shí)保持?jǐn)?shù)據(jù)質(zhì)量(圖 5b.)。在實(shí)踐中,流式細(xì)胞術(shù)聲波聚焦可使細(xì)胞采樣頻率提高約 20 倍(圖 6)。
圖 6:基于流體流式細(xì)胞術(shù)(A、B、C)與聲波聚焦細(xì)胞術(shù) (D) 對(duì)比的各種流式細(xì)胞術(shù)設(shè)備采樣時(shí)間比較。(圖片來(lái)源:Thermo Fischer Scientific)
在圖 6 中,A、B 和 C 的設(shè)備采用流體力學(xué)技術(shù),而 D 則采用聲波聚焦流式細(xì)胞術(shù)方法。
聲波聚焦流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)采集
聲波聚焦流式細(xì)胞術(shù)設(shè)備的電子元件設(shè)計(jì)需要高速光敏電子元件,以適應(yīng)血液細(xì)胞和鞘液通過較大直徑噴嘴的速度。前面提到的 600 MHz 高速 LTC6268 與專門的 0805 電阻封裝布局相結(jié)合,使光感應(yīng)速率高達(dá) 11.4 MHz(圖 7 左)。LTC6268 的輸出被送入Analog Devices ADAQ23878 ADC 進(jìn)行數(shù)字化。
圖 7:ADAQ23878 ADC 將光電二極管 (PD1) 和 TIA 電路(左)的光信號(hào)數(shù)字化。(圖片來(lái)源:Bonnie Baker)
ADAQ23878 是一款 18 位、每秒 15 兆次采樣 (MSPS) 的精密高速系統(tǒng)級(jí)封裝 (SIP) 數(shù)據(jù)采集解決方案。它將設(shè)計(jì)人員所面對(duì)的輸入驅(qū)動(dòng)元器件選擇、優(yōu)化和布局等設(shè)計(jì)挑戰(zhàn)轉(zhuǎn)移至設(shè)備,從而極大地縮短了精密測(cè)量系統(tǒng)的開發(fā)周期。
這種 SIP 的模塊化方法通過將多個(gè)通用信號(hào)處理和調(diào)節(jié)模塊與高速、18 位、15 MSPS 逐次逼近寄存器 (SAR) ADC 組合在一個(gè)設(shè)備中,減少了終端系統(tǒng)的元器件數(shù)量。這些模塊包含一個(gè)低噪聲、全差分 ADC 激勵(lì)放大器和一個(gè)穩(wěn)定的參考緩沖器。
ADAQ23878 還集成了關(guān)鍵的無(wú)源元器件,它們采用 Analog Devices 的iPassive 技術(shù),可最大限度地減少與溫度有關(guān)的誤差源并優(yōu)化性能。ADC 快速建立的驅(qū)動(dòng)級(jí)有助于其確??焖贁?shù)據(jù)采集。
評(píng)估 ADAQ23878 μModule為了評(píng)估 ADAQ23878,Analog Devices 提供了 EVAL-ADAQ23878FMCZ 評(píng)估板(圖 8)。該評(píng)估板可展示 ADAQ23878 μModule 的性能,是用于評(píng)估流式細(xì)胞術(shù)前端設(shè)計(jì)和其他各種應(yīng)用的一款多功能工具。
圖 8:用于 ADAQ23878 的 EVAL-ADAQ23878FMCZ 評(píng)估板板載電路,配備用于控制和數(shù)據(jù)分析的關(guān)聯(lián)軟件,并且兼容 SDP-H1。(圖片來(lái)源:Analog Devices)
EVAL-ADAQ23878FMCZ 評(píng)估板需要一臺(tái)運(yùn)行 Windows 10 或更高版本的個(gè)人計(jì)算機(jī)、一個(gè)低噪聲的精密信號(hào)源以及一個(gè)適合 18位測(cè)試的帶通濾波器。該評(píng)估板需要 ADAQ23878 ACE 插件和 SPD-H1 驅(qū)動(dòng)器。
雖然使用標(biāo)準(zhǔn)的流體力學(xué)聚焦流式細(xì)胞術(shù)逐一檢查生物細(xì)胞已取得成功,但由于需要加快分析速度,人們開始轉(zhuǎn)而改用以聲波聚焦流式為主的方法。因此,若要支持更先進(jìn)的流式細(xì)胞術(shù),電子元件也必須改進(jìn),同時(shí)盡量縮小空間、節(jié)約成本并縮短開發(fā)時(shí)間。如本文所述,LTC6268 高速運(yùn)算放大器可與 ADAQ233878 精密、高速、μModule 數(shù)據(jù)采集解決方案相結(jié)合,為先進(jìn)的流式細(xì)胞術(shù)設(shè)備建立完整的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng),從而保證快速的數(shù)據(jù)采集。
(作者:Bonnie Baker,來(lái)源:DigiKey得捷)
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